高分 SCI 收割机，单细胞测序的技术演变及应用（附 3 个案例）

今年，一篇发表在 science 子刊的文章 [1] ，分析了 28,578 个患者样本，发现在接种疫苗后，与 Alpha 变体相比，Beta、Gamma 和 Delta 变体感染 SARS-CoV-2 的风险更高UMI。 而在这个大规模实验过程中，单细胞 + 第三代测序技术功不可没。

近年来，单细胞测序技术在肿瘤微环境和细胞通讯等领域也有诸多优势，但却难以获得单个细胞中全长转录本的准确信息 [2][3] UMI。

为了解决这一核心困难，三代测序研究如火如荼的开展UMI。最终实现了高通量、低成本的单细胞全长转录组研究。今天我们就一起来看看，单细胞转录组测序的「蜕变」历程。

经典起源： ScISOr-Seq

2018 年 10 月 20 日，Ishaan Gupta 等人开发了一种将单细胞转录组测序与全长转录组测序相结合的测序分析方法—single-cell isoform RNA-Seq（ScISOr-Seq） [4] UMI。

利用 10x Genomics 单细胞平台进行单细胞的捕获和全长 cDNA 的扩增，将全长 cDNA 一分为二，一份进行短读长 Illumina 3' 测序，可以提供常规单细胞分析，另一文库进行三代全长测序，鉴定 isoformUMI。

图 1：ScISOr-Seq 技术路线 [4]

通过该方法检测到了 17 种不同类型的细胞和转录组中已知的 isoform，并且发现了 16,872 个新的 isoform 以此进一步改进了鼠基因组注释版本，同时也检测到了更多的可变剪接UMI。

图 2：左图为基于短读长测序的细胞聚类；右图为各细胞类型中阿尔茨海默症相关基因 Bin1 的 Isoforms 比较 [4]

ScISOr-Seq 也有一些局限性，对三代 15～20 K 的 hifi 读长只能利用其中的 1～2 K，导致性价比较低，无法通过纯三代测序直接实现定量和结构同时解析UMI。

飞速发展： HIT-scISOseq

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2020 年 7 月，肖传乐老师 [5] 等人开发了一种三代的单细胞转录组测序技术 HIT-scISOseq（High-throughput single-cell isoform sequencing）UMI。

通过 PCR 来捕获全长 cDNA 以及创制从头到尾连接步骤，将多个 cDNA 分子首尾相连成长链 cDNA 分子，使单个测序的核酸分子长度提高了 3～5 倍，然后进行 Pacbio HiFi 测序UMI。

较 scIso-Seq 相比，该方法不仅可以有效降低容错且可从更少的 reads 中获得更多的转录本，从而提供了多 8 倍的数据输出UMI。

图 3：HIT-scISOseq 实验技术路线以及和上一代技术对比 [5]

作者通过 HIT-scISOseq 构建了正常和受伤的猕猴角膜上皮细胞的全长转录组图谱，确定了与损伤相关的转录本剪切和转换机制；同时与二代平台 NGS 技术比较发现，两个平台在 UMI 计数等方面表现了很高的一致性且 HIT-scISOseq 自身重复性较好UMI。

图 4：HIT-scISOseq 定量一致性展示 [5]

HIT-scISOseq 代表了一种高通量、高性价比、技术简单的方法从而实现直接对基因进行定量同时可得到全长转录本的准确信息，有利于检测更多的可变剪接、融合基因、突变位点等信息UMI。

进阶蜕变： MAS-ISO-Seq

2021 年 10 月，Aziz M. [6] 等人开发了 MAS-ISO-Seq，也是目前为止较好的三代单细胞全长转录组解决方案UMI。

该方案相比 HIT-scISOseq 不同转录本用相同的方式随机连接的方案，开创性的将 cDNA 均分成 15 份，每份的两端分别连接带有 U 的不同小片段，后续通过粘性末端互补配对将不同文库的相同末端片段首尾连接，实现了 15 个不同 cDNA 分子随机有方向的串联，大大增加了上机测序的最终 cDNA 长度和最终有效全长转录本的产出UMI。技术路线如下图所示：

图 5：MAS-ISO-Seq 技术路线 [6]

由于极大的提高了测序产出和完整性，此方案可以在三代测序上直接实现基于定量和结构上的同时分析UMI。

为了验证短读长与长读长测序方法结果的一致性，作者比较短读长异构体重建与高通量长读长测序方法，两种方案的 ERCC 标准的定量总体上大致相似UMI。

图 6：MAS-ISO-Seq 产出和一致性验证 [6]

同样为了表征 MAS-ISO-Seq 在单细胞 RNA 测序中的性能，作者对肿瘤浸润的 CD8+ T 细胞进行了10x 5’ 单细胞转录组测序，一共获得了 6,260 个 CD8+ T 细胞，尽管短读和长读方法和定量方法之间的测序深度有很大差异，但细胞聚类和基因表达高度一致UMI。

图 7：MAS-ISO-Seq 和传统 NGS 细胞类型和比例对比展示 [6]

图 8：MAS-ISO-Seq 和 NGS 测序基因数对比 [6]

安诺优达第三代单细胞全长转录组技术

安诺优达长期追踪单细胞领域的最新应用，目前经过不断的优化研发已经成功复现 MAS-ISO-Seq，并计划在 2022 年第四季度推出商业应用UMI。

发布之前如果有想尝鲜共同研发测试的科研小伙伴可以通过 TS_Support@genome.cn安诺技术支持邮箱与我们联系，提前尝鲜UMI。邮件主题： 「安诺科研共创计划 」，正文包括您的姓名、电话、工作单位、研究物种、科学问题等，我们会在 24 h 内与您联系。

安诺科研共创计划

为了进一步扩大应用，安诺优达特在如下应用领域发起「科研共创计划」，招募不超过 8 个研究课题，并为「科研共创计划」参与者提供高附加值的服务，配套经验丰富的生产、研发团队，CNS 主刊文章作者主导的生信分析UMI。对于科研价值最高的 3 个项目提供不低于 1:1 的资源配套。

项目申请时间：即日起-2022 年 11 月 15 日

1、科研共创计划课题

●人、鼠、大型哺乳动物单细胞全长转录组各种免疫和发育相关深度研究应用；

●不同肿瘤类型/泛癌单细胞全长转录组应用；

●其他高科研价值课题UMI。

2、评审标准

项目入选「科研共创计划」需要科研工作者提供研究方案概述，并阐述团队基础，安诺研发团队会综合方案系统性、课题创新性、样品代表性和系统性、技术可行性等综合评估UMI。

3、报名方式

发送邮件邮箱至 TS_Support@genome.cn，主题 「安诺科研共创计划」，正文包括您的姓名、电话、工作单位、研究物种、科学问题等，我们会在 24 h 内与您联系UMI。

参考文献

[1]. Andeweg SP, Vennema H, Veldhuijzen I, et al. SeqNeth Molecular surveillance group†; RIVM COVID-19 Molecular epidemiology group†. Elevated risk of infection with SARS-CoV-2 Beta, Gamma, and Delta variant compared to Alpha variant in vaccinated individuals. Sci Transl Med. 2022 Jul 21:eabn4338. doi: 10.1126/scitranslmed.abn4338.

[4]. Gupta I, Collier P G, Haase B, et al. Single-cell isoform RNA sequencing characterizes isoforms in thousands of cerebellar cells[J]. Nature biotechnology, 2018, 36(12): 1197-1202. doi:10.1038/nbt.4259

[5]. Zheng Y, Chen Z, Shi Z, et al. HIT-scISOseq: High-throughput and High-accuracy Single-cell Full-length Isoform Sequencing for Corneal Epithelium[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2020.

[6]. Aziz M, Jonathan T, Kiran V, et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmable cDNA concatenation[J]. bioRxiv, 2021